货号:V5007L, V5008L
产品组成
Component | V5007L (200 rxn, 25 μl/rxn) | V5008L (5000 rxn, 25 μl/rxn) |
One Step Prime RT-qPCR Enzyme Mix(Lyophilized) * | 100 rxn × 2 | 100 rxn × 50 |
Enzyme Mix Buffer (2X) | 1.25 ml × 2 | 1.25 ml × 50 |
*包含逆转录酶,RNase抑制剂,热敏UDG酶,热启动DNA聚合酶,dNTPs包含dUTP。
保存条件
2~8℃
产品简介
2X One Step Prime RT-qPCR Mix 是用于一步法多重荧光定量PCR的试剂。它以探针和特异性引物来定量检测RNA或DNA靶标序列。优化的缓冲液组分可以协助在一个体系内完成多达4个RNA或DNA序列的多重定量PCR。
该混合液以2倍浓度提供,能够加入更多的模板进行反应,从而提高检测的灵敏度。冻干的One Step Prime RT-qPCR Enzyme Mix试剂将耐热逆转录酶、热启Taq DNA聚合酶、热敏UDG酶、dNTPs等做成冻干品试剂,制品性能更稳定,可长期保存。
应用举例
1. 准备Master Mix:
取出冻干的One Step Prime RT-qPCR Enzyme Mix,平衡至室温后取1支冻干粉溶解于1.25 ml Enzyme Mix Buffer中,避免产生气泡。吹打清洗管壁,防止冻干粉残留。将管子放在一边静置30 min。
注意:重悬的Master Mix可以在-20℃保存 1年,4℃ 保存7天。
2. 准备反应体系
2.1 按下表于冰上配置反应体系。于冰上融化所有试剂。配制多个反应孔时,请为各组分预留10%的余量,以免移液损失。
2.2反应体系配好后,用光学贴膜覆盖反应板,充分翻转混匀,离心。
快速反应体系:
组分 | 体积 | 终浓度 |
重悬的Master Mix | 12.5 μl | 1X |
引物-探针 | 1 μl | 引物:400-900 nM 探针:100-250 nM |
样品* | 根据需要调整 | 1 pg-100 ng |
RT-PCR级超纯水 | 根据需要调整 | – |
总体积 | 25 μl |
标准反应体系:
组分 | 体积 | 终浓度 |
重悬的Master Mix | 25 μl | 1X |
引物-探针 | 2 μl | 引物:400-900 nM 探针:100-250 nM |
样品* | 根据需要调整 | 1 pg-100 ng |
RT-PCR级超纯水 | 根据需要调整 | – |
总体积 | 50 μl |
* DNA 或 RNA 样本均可,逆转录反应并不会对 DNA 样本造成影响。
3. 运行 RT-qPCR 反应程序
快速反应体系:
步骤 | 阶段 | 循环数 | 温度 | 时间 |
逆转录 | 1 | 1 | 55°C * | 10 min |
预变性 | 2 | 1 | 95°C | 2 min |
扩增 | 3 | 45 | 95°C | 5 sec |
60°C | 30 sec |
标准反应体系:
步骤 | 阶段 | 循环数 | 温度 | 时间 |
逆转录 | 1 | 1 | 55°C * | 10 min |
预变性 | 2 | 1 | 95°C | 2 min |
扩增 | 3 | 45 | 95°C | 15sec |
60°C | 60 sec |
* 逆转录反应的温度可以在 48℃至55℃之间进行调整。
4. 实验数据分析
针对不同的仪器类型,数据分析也略为不同。一般情况下,数据分析主要包括:
1.观察扩增曲线,根据需要进行设置,比如:
a.设置合适的基线和阈值线
b.将一些典型的异常值从分析中剔除掉
2.在孔位表或者结果表中,观察复孔之间的 Ct 值是否有差异;
3.对于绝对定量,观察标准曲线的斜率、扩增效率、R2值、截距、Ct 值和异常值。