在前两期「新手实验课」中，我们分别介绍了核酸电泳和PCR。PCR可以帮助我们将特定的DNA片段进行大量扩增，而当我们希望进一步了解：

“目标核酸有多少？”

“不同样本之间的起始模板量有什么差异？”

“扩增过程是否正常？”

这时候，就需要用到一种非常重要的分子生物学技术——qPCR。本期我们就从最基础的概念开始，带大家认识 qPCR。

如果你已经做过普通PCR，那么理解qPCR其实并不难。普通PCR（PCR）的主要过程是：

DNA模板 → 扩增 → PCR结束 → 电泳检测

PCR结束后，我们通常通过琼脂糖凝胶电泳观察是否出现目标条带，以及条带大小是否符合预期。

而qPCR最大的不同在于：

DNA模板 → 扩增 → 实时检测荧光信号 → 数据分析

也就是说，qPCR并不是等PCR反应结束后才检测，而是在PCR扩增的同时实时监测荧光信号的变化。

简单来说：

因此，可以把qPCR理解为：

“在PCR扩增过程中，一边扩增，一边检测。”

这就要说到qPCR中的核心——荧光信号。

在qPCR反应体系中，需要加入能够反映扩增产物形成的荧光检测体系。

常见的方式主要包括：

SYBR Green法

SYBR Green是一种能够与双链DNA结合的荧光染料。

随着PCR反应不断进行，双链DNA扩增产物增加，结合的荧光染料也随之增加，因此荧光信号会逐渐增强。优点：

体系相对简单

成本较低

设计和操作相对方便

但由于SYBR Green可以与不同的双链DNA结合，因此需要特别关注非特异性扩增和引物二聚体。

Probe探针法

Probe法则使用具有特异性的荧光探针。

当目标序列发生扩增时，探针参与反应并产生可被仪器检测的荧光信号。相比SYBR Green法，Probe法具有更高的序列特异性，也非常适合：

病原体检测

基因表达分析

SNP检测

多重检测（Multiplex qPCR）

理解qPCR，可以把整个过程简单分成以下几个阶段：

其中，Master Mix是qPCR反应体系的重要组成部分。

通常，一个完整的qPCR体系包括：

DNA模板

Forward Primer

Reverse Primer

荧光检测体系（SYBR Green或Probe）

DNA Polymerase

dNTPs

Mg²⁺

Buffer及其他反应组分

使用预混液（Master Mix）的一个重要优势，就是可以将多种反应组分预先优化和混合。

实验人员通常只需要根据产品说明书加入：

Template + Primers + Probe（或染料体系）+ Master Mix

即可建立反应体系。

第一次接触qPCR，最容易“看不懂”的就是扩增曲线。

一张典型的qPCR扩增曲线通常可以分为几个阶段：

可以简单理解为：

PCR前期“增长很快”，后期逐渐“增长变慢”，最终进入平台。

如果说qPCR中有一个参数是新手必须理解的，那就是：Ct / Cq

Ct通常指：Cycle threshold

也就是：荧光信号达到设定阈值时所对应的PCR循环数。

例如：

Sample A：Ct = 20

Sample B：Ct = 25

在其他实验条件相近、扩增效率良好的情况下，通常意味着：

Sample A中的起始目标模板量高于Sample B。

因为起始模板越多，通常越早达到设定的荧光阈值。

所以可以简单记住：

起始模板越多 → 通常越早达到阈值 → Ct越小

但需要注意：

Ct值不能脱离具体实验体系单独解释。

不同的引物、扩增效率、模板质量、反应体系以及仪器设置，都可能影响Ct值。

📈 ① Amplification Curve

扩增曲线主要用于判断：

是否发生扩增

扩增是否正常

样本之间的Ct/Cq差异

阴性对照是否出现异常信号

典型的阳性样本通常会出现明显的S形扩增曲线。

📊 ② Standard Curve

如果进行绝对定量，就可能需要建立标准曲线。

通过不同浓度的标准品进行qPCR，可以建立模板浓度与Ct值之间的关系。

标准曲线通常可以用于评估：

扩增效率

线性关系

R²等参数

🔬 ③ Melt Curve

熔解曲线主要用于SYBR Green体系。

它可以帮助判断扩增产物的特异性。

例如单一、清晰的熔解峰，通常说明体系中以一种主要扩增产物为主。

如果出现多个峰，则可能提示存在非特异性扩增或其他产物。

因此，在使用SYBR Green进行qPCR时，Melt Curve是非常值得关注的结果之一。

新手第一次做qPCR，可能会遇到很多问题。例如：

没有扩增曲线

可能与以下因素有关：

模板质量或浓度不合适

引物设计问题

反应体系配置错误

PCR程序不合适

试剂失效等

NTC出现扩增

NTC（No Template Control）是不加入模板的阴性对照。

如果NTC出现明显扩增，需要考虑：

试剂或操作污染

非特异性扩增

引物二聚体

体系设计问题

Ct值重复性差

可能与：

移液误差

模板浓度不均一

反应体系不稳定

气泡

仪器或耗材差异

等因素有关。

因此，良好的实验操作和稳定的qPCR试剂体系同样重要。

对于新手来说，可以从以下几个方面入手：

1. 保证模板质量

避免模板降解，并尽量控制模板浓度和纯度。

2. 优化引物

引物设计直接影响扩增效率和特异性。

3. 设置合理的对照

根据实验目的设置：

NTC

Positive Control

Reference Gene

Standard等

4. 减少移液误差

对于小体积qPCR反应，移液误差可能会明显影响结果。

5. 选择稳定的Master Mix

一个经过优化的qPCR Master Mix能够帮助实验人员减少体系优化工作，提高实验重复性。

qPCR已经广泛应用于生命科学研究和分子检测。例如：

🧬 Gene Expression Analysis

基因表达分析

🦠 Pathogen Detection

病原体检测

🔬 DNA Quantification

DNA定量

🧪 Genotyping

基因分型

🧬 SNP Detection

SNP检测

🔬 Research Diagnostics

科研领域的分子检测

如果进一步结合逆转录步骤，还可以使用RT-qPCR对RNA进行检测和分析。

这也是下一阶段非常值得学习的内容。

如果用一句话总结今天的内容：

PCR负责扩增目标DNA，而qPCR在扩增的同时，通过实时监测荧光信号变化来分析扩增过程和目标核酸。

从实验流程来看：

Template

↓

PCR Amplification

↓

Fluorescence Detection

↓

Amplification Curve

↓

Ct/Cq

↓

Data Analysis

这就是qPCR最基本的工作逻辑。

掌握了这些基础概念之后，你就已经迈出了理解qPCR数据的重要一步。

稳定的反应体系是获得可靠qPCR结果的重要基础。

东盛生物提供多种qPCR相关产品，涵盖 SYBR Green qPCR、Probe qPCR 以及多重探针qPCR等应用，可根据不同实验需求选择合适的反应体系。

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