KASP（Kompetitive Allele-Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR）是一种基于PCR的基因分型技术，主要用于检测单核苷酸多态性（SNP）和其他特定基因变异。广泛应用于农业育种、医学研究、群体遗传学等领域。
引物设计开发流程如下
- 获取SNP信息，要求两亲本在SNP位置的碱基序列不同，同时该SNP上游20bp、下游40bp无其他SNP, SNP信息可通过全基因组测序得到，也可通过重测序得到；
- 提取亲本DNA、F1代DNA
- 引物设计：
- 从SNP所在碱基开始往上游数20bp作为左引物f，SNP的碱基作为左引物的第20个碱基，于是有左引物f1，f2;
- 使用引物设计软件或引物设计网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）固定左引物f，通过blast得到右引物R，产物大小需小于60bp；
- 左引物f1、f2分别加上接头A1、A2（接头序列A1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，A2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT）序列为F1、F2，即F1=A1f1，F2=A2f2；
- 合成序列F1，F2，R，选用ULTRPAGE纯化方式；
- 将引物干粉溶解，按比例配制成Primer Mix
- 引物筛选：每种引物每个亲本及F1最少跑2个孔。
- 扩增结束后使用荧光定量PCR读带：读带程序如下：
25℃ for 5s + Plate Read。读带完成后，选定荧光类型FAM、HEX、ROX,选择Allelic Discrimination进行分析 - 挑选其中聚类明显的引物作为候选标记。
- 将候选标记用于群体，若聚类效果明显则可作为KASP标记，聚类效果不明显则不能作为标记。
一般来说，实验初期需要选择多个位点设计不同引物进行实际验证，从中选出聚类效果明显的作为最终的引物用于实验。KASP 本身是一个非常依赖引物设计的技术，如果反复优化无果，很可能引物在 SNP 区位的设计可以进一步改善。
配置反应体系
- 模板DNA：通常每个反应加入2.5-25ng/ul高质量DNA可满足分型需求。具体投入量根据实验使用物种的基因组大小判断，遵循大基因组高投入，小基因组低投入原则投入适当DNA。请尽量保持DNA浓度一致。
- 引物：按比例混合 F1、F2、R 各为 10 μM 的 Primer Mix（体积比 1:1:2.5）
- KASP PCR MixPlus : KASP PCR Mix、KASP Probe Mix 全部组分混合振荡均匀
PCR扩增体系如下(10ul体系)
| Component | Volume |
| DNA | 25-250ng |
| KASP PCR MixPlus | 5ul |
| Primer mix | 0.76ul |
| 超纯水 | 补齐至10ul |
阴性对照设置
为保证基因分型数据的准确性，除测试样品外，还应在PCR板上使用对照样品。建议每个基因分型板上包含两个NTCs (无模板对照)。NTC孔的荧光信号强度与模板DNA孔的信号强度差异可以提高对基因分型数据有效性的判定。通常NTC样品的信号值应接近原点，NTC孔中观察到的任何扩增都表明存在污染或非特异性扩增，能够辅助分型数据的判读。
设定反应程序进行KASP反应
| Stage | Temperature | Time | Number of Cycles |
| Hot-start Taq activation | 95℃ | 1 min | 1 |
| Touchdown | 95℃ | 15 sec | 10 |
| 60→54℃，-0.6℃/循环 | 15 sec | ||
| 72℃ | 20 sec | ||
| Amplification | 95℃ | 15 sec | 26-35 |
| 54℃ | 15 sec | ||
| 72℃ | 20 sec | ||
| Read | 30℃ | 60 sec | 1 |
循环数建议根据物种基因组大小和投入量确定，如首次实验无成熟程序，建议采取26个循环进行初始反应，后续逐次增加循环进行最适条件摸索。
若初始PCR扩增结束后未获得明确基因型分簇，可以按照扩增循环条件增加3个循环(94°C 20 sec，57°C 60 sec)，并再次读取和分析荧光信号值。若分簇结果仍不够理想，可以继续增加PCR循环，直至观察到紧密且分离良好的基因型分簇为止。
荧光读取
选定荧光类型FAM、HEX、ROX,选择Allelic Discrimination进行分析（根据实际仪器进行操作）