KASP（Kompetitive Allele-Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR）是一种基于PCR的基因分型技术，主要用于检测单核苷酸多态性（SNP）和其他特定基因变异。广泛应用于农业育种、医学研究、群体遗传学等领域。
引物设计开发流程如下
- 获取SNP信息，要求两亲本在SNP位置的碱基序列不同，同时该SNP上游20bp、下游40bp无其他SNP, SNP信息可通过全基因组测序得到，也可通过重测序得到；
- 提取亲本DNA、F1代DNA并稀释到5-50ng/ul备用(也可以不稀释，后面扩增体系里面用水补齐)；
- 引物设计：
- 从SNP所在碱基开始往上游数20bp作为左引物f，SNP的碱基作为左引物的第20个碱基，于是有左引物f1，f2;
- 使用引物设计软件或引物设计网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）固定左引物f，通过blast得到右引物R，产物大小需小于60bp；
- 左引物f1、f2分别加上接头A1、A2（接头序列A1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，A2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT）序列为F1、F2，即F1=A1f1，F2=A2f2；
- 合成序列F1，F2，R，选用ULTRPAGE纯化方式；
- 将引物干粉溶解，F1、F2浓度为36uM，R浓度为90 uM，然后三种引物按体积比1:1:1混匀为primer mix；
- 引物筛选：每种引物每个亲本及F1最少跑2个孔。
PCR扩增体系如下
| component | volume(ul) |
| DNA | 5 |
| KASP PCR MIX | 5 |
| Primer mix | 0.14 |
- 扩增结束后使用荧光定量PCR读带：读带程序如下：
25℃ for 5s + Plate Read。读带完成后，选定荧光类型FAM、HEX、ROX,选择Allelic Discrimination进行分析 - 挑选其中聚类明显的引物（如右图）作为候选标记。
- 将候选标记用于群体，若聚类效果明显则可作为KASP标记，聚类效果不明显则不能作为标记。