核心原理概述
该试剂盒的核心原理是：利用高离序盐（如盐酸胍，通常存在于溶液RL中）使细胞裂解，同时抑制RNase活性；然后通过调节盐浓度和乙醇浓度，使RNA选择性地吸附到硅胶膜上；之后用洗涤液去除杂质；最后用无RNase水将RNA从膜上洗脱下来。
详细步骤分析
准备工作：在溶液RPI、RW中加入无水乙醇
- 作用：溶液RPI和RW是洗涤液，其有效成分溶解在乙醇中。加入乙醇是为了使洗涤液具备适当的洗涤能力：
- RPI：通常含有高浓度离序盐和乙醇，用于去除残留的蛋白质、盐类等杂质，并维持RNA结合在膜上的条件。
- RW：通常是低盐的乙醇溶液，用于去除盐分并带走残留的有机物，同时使乙醇挥发，为后续的洗脱做准备。
第1步：样品处理与裂解
- 作用：彻底破碎细胞，释放RNA，并立即灭活RNase。
- 关键试剂：溶液RL（裂解液）
- 它通常含有强变性剂（如盐酸胍或异硫氰酸胍），能迅速破坏细胞膜和核膜，使蛋白质变性，并高效地抑制内源性和外源性的RNase，防止RNA被降解。
- 注意点：
- 组织研磨：液氮研磨能瞬间低温固定组织，防止RNA降解。
- 不加量不足：裂解液不足会导致裂解不彻底，部分RNase可能仍有活性，且基因组DNA会因粘度高而难以完全去除，导致DNA污染。
- 不洗涤细胞：PBS等洗涤液可能引入RNase或导致细胞在悬浮过程中裂解，mRNA会在此过程中迅速降解。
第2步：室温孵育
- 作用：确保裂解反应和核酸-蛋白复合物的解离完全进行，让RNA充分释放到裂解液中。
第3步：可选离心/酚氯仿抽提
- 作用：预清除杂质。
- 常规离心：对于蛋白、脂肪、多糖含量高的样品，此步骤可以去除这些不溶性杂质，防止它们堵塞纯化柱。上清中含有RNA、DNA、可溶性蛋白等。
- 酚氯仿抽提（针对多糖多酚植物样品）：
- 高盐（NaCl）：使多糖更易沉淀到有机相或界面。
- 酚/氯仿：酚是强变性剂，能有效沉淀蛋白质；氯仿能促进相分离并带走脂肪。这个步骤能强力去除大部分蛋白质、多糖、脂质和DNA，得到一个相对纯净的含RNA的上清液，极大减轻后续纯化柱的负担，提高植物RNA的产量和质量。
第4步：加入氯仿
- 作用：液-液萃取，分离RNA。
- 原理：氯仿是一种有机溶剂。加入氯仿并离心后，溶液会分为三层：
- 上层（无色水相）：含有RNA（由于RNA是亲水的）。
- 中间层（白色）：变性的蛋白质和DNA。
- 下层（黄色有机相）：脂类、色素、疏水性蛋白及其他细胞碎片。
- 通过此步骤，RNA被富集在水相中，与绝大部分蛋白质、DNA和脂质分离开。
第5步：离心并转移水相
- 作用：精确收集含有RNA的水相。
- 关键：必须非常小心，只吸取无色的上层水相，绝对不能触碰到中间的白色蛋白层，否则会导致严重的蛋白质和DNA污染。
第6步：加入乙醇并上柱
- 作用：创造RNA结合到硅胶膜上的最佳条件。
- 原理：在高离序盐（来自裂解液残留）存在的条件下，加入乙醇使溶液环境成为“低水相”。在这种环境下，RNA的磷酸骨架会暴露，并通过氢键和静电作用力可逆地吸附在硅胶膜上。而其他杂质（如蛋白质、代谢物）则不能有效吸附，随溶液流走。
- “可能会出现沉淀”：这通常是盐（如SDS在乙醇中沉淀）或某些杂质在乙醇中析出，不影响RNA的结合。
第7步：用溶液RPI洗涤
- 作用：第一次洗涤，去除残留的蛋白质、盐分和其他杂质。
- 原理：RPI中含有离序盐和乙醇，能维持RNA结合在膜上的状态，同时将未能紧密结合的杂质洗脱掉。
第8-9步：用溶液RW洗涤（两次）
- 作用：第二次和第三次洗涤，彻底去除盐分和残留的乙醇，为RNA洗脱创造纯净的环境。
- 原理：RW是低盐的乙醇缓冲液。它能：
- 洗去残留的离序盐。盐分如果残留，会抑制后续的酶反应（如逆转录、PCR）。
- 乙醇能带走残留的有机物并促进液体挥发。
- 静置2分钟：让洗涤液与膜充分接触，确保盐分被完全洗去。
第10步：高速空离
- 作用：彻底去除残留的乙醇。
- 关键性：这是至关重要的一步。哪怕微量的乙醇残留都会严重抑制后续的酶促反应。离心后通风晾干是为了让痕量的乙醇彻底挥发。
第11步：洗脱
- 作用：将纯净的RNA从硅胶膜上释放下来。
- 原理：使用无RNase的水（低盐或无盐环境） 破坏RNA与硅胶膜之间的氢键和静电作用，使RNA重新溶解到水中，从而被洗脱下来。
- 室温放置2分钟：让水与膜充分接触，使RNA水合溶解，提高洗脱效率。
- 提高得率技巧：用少量水（如30-50μl）洗脱一次后，将得到的洗脱液重新加回到同一个纯化柱中，离心第二次，可以显著提高RNA的最终浓度。
- 保存：RNA在-70°C以下可以长期稳定保存，因为超低温能最大限度地抑制所有RNase的活性。
总结
这个流程是一个经典的 “裂解 -> 相分离 -> 结合 -> 洗涤 -> 洗脱” 过程。每一步都环环相扣，旨在最大限度地获得高纯度、高完整性且无酶抑制物污染的RNA，为下游实验（如qRT-PCR、RNA测序等）的成功奠定基础。