1. 简介与初步诊断
本指南用于排查实验室进行 KASP 基因分型时出现的异常图像。在进行深入分析前，建议：
- 优先重复： 先重复实验一次（同 DNA + 同试剂），排除偶发的人为移液误差。
- 分类讨论： 全板异常看系统（试剂/仪器）；单个位点异常看引物设计。
2. 全局通用问题清单
| 分类 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 分型结果差 | 加样不一致 | 检查移液器精度；通过观察 ROX 荧光的均一性来评估加样。 |
| 无信号/信号弱 | PCR 程序执行错误 | 核对循环条件、退火温度；检查读板参数是否开启。 |
| 信号异常偏移 | 板封不良/蒸发 | 必须使用光学级封板膜；确保读板温度 < 40°C。 |
| 背景噪声高 | 仪器参数错误 | 设置正确的激发/发射波长（FAM/HEX/ROX）。 |
3. 核心故障深度排查表 (3.1 - 3.10)
| 故障现象 | 典型表现 | 可能原因 | 推荐方案 |
|---|---|---|---|
| 3.1 扩增不足 | 数据点密集靠近原点 | 循环数不足；DNA 浓度极低 | 增加 3-5 个循环；提高 DNA 浓度 |
| 3.2 分群散乱 | 点无规律分布，不聚类 | DNA 质量差；试剂污染 | 重提 DNA；更换新试剂或超纯水 |
| 3.3 杂/纯合难分 | 三群重叠或间距过小 | 退火温度不匹配；设计缺陷 | 优化退火温度；必要时重新设计引物 |
| 3.4 杂合群靠原点 | 杂合子向(0,0)位漂移 | 扩增效率低；DNA 起始量少 | 提高 DNA 浓度；增加 PCR 循环数 |
| 3.5 分群过多 | 出现 >3 个独立簇 | 引物结合位点存在多态性 | 重设引物，避开多态位点 |
| 3.6 分群过少 | 仅 1-2 簇，无分群 | 样本量太少(<22个)；SNP 假阳性 | 增加样本多样性；验证 SNP 真实性 |
| 3.7 部分不扩增 | 部分样本点留在原点 | DNA 降解；存在抑制剂 | 重新提取 DNA；稀释样本 (1:10) |
| 3.8 NTC 出现信号 | NTC 点向坐标轴偏移 | 试剂污染；引物二聚体严重 | 更换超纯水；缩短退火时间 |
| 3.9 分群融合 | 簇与簇之间连在一起 | 坐标轴缩放问题；信号弱 | 调整软件 Scale 对齐；提高扩增效率 |
| 3.10 放射状图像 | 点从原点向外散开 | 系统性加样/校准误差 | 检查板位是否放反；校准读板仪 |
4. 推荐优化建议
4.1 DNA 与样本要求
- 最低浓度： 最终反应体系中建议 ≥ 2.5 ng/µL。
- 最小样本量： 每板建议至少 22 个 DNA 样本 + 2 个 NTC，以辅助软件自动聚类。
4.2 试剂与读板优化
- MgCl₂： 低 GC 引物建议增加 Mg²⁺ 提高扩增效率。
- DMSO： 高 GC 模板建议添加 1-5% 辅助解链。
- 温度控制： 严禁在热板状态下读板，荧光信号随温度升高而骤减。
5. 一句话判断逻辑
- 全板不动： 查程序、查试剂、查波长。
- 点在原点不走： 增加 5 个循环试试看。
- NTC 跟着样本跑： 环境污染，必须清理工作台。
- 分群散乱： 优先考虑 DNA 质量问题。
- 杂合子分不开： 调整退火温度或重选引物。
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