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DNA 电泳是分子生物学实验的“基本功”，几乎所有科研人员都绕不开。虽然操作看似简单，但原理与细节不少，一旦忽视就可能导致条带模糊、结果失真，甚至实验“全军覆没”。今天我们来拆解几个常见的误区，从理论到实践，帮你真正理解电泳原理，少走弯路。

⚡️ 原理回顾：DNA 为什么能“跑起来”？

DNA电泳过程示意图

DNA 电泳依赖的是 电场驱动：带负电荷的 DNA 分子在电场中向正极迁移。迁移速度主要受以下因素影响：

分子大小：小分子 DNA 在凝胶孔隙中阻力小，迁移更快。

琼脂糖浓度：浓度越高，凝胶网孔越密，分辨小分子的能力更强。

电压与缓冲液：电压过高会导致发热，缓冲液离子浓度不当会影响电流与分辨率。

核酸构象：线性 DNA、超螺旋质粒、开环质粒迁移速度各不相同，超螺旋质粒 > 线性 DNA > 开环质粒。

超螺旋质粒（Supercoiled DNA）构象紧密，分子呈现高度压缩状态。在凝胶孔隙中受到的阻力最小 → 迁移速度最快。

线性 DNA（Linear DNA）构象伸展，迁移速度主要取决于分子大小。一般情况下，速度介于超螺旋和开环之间。

开环质粒（Nicked/Relaxed Circular DNA）因单链切口导致环形松弛，构象最“蓬松”。在凝胶中阻力最大 → 迁移速度最慢。

理解这些原理，才能真正避免实验中“看不懂”的现象。

🚩 常见误区一：琼脂糖浓度随意配

琼脂糖是从海藻中提取的一种线性聚合物，加热溶解后再冷却会形成具有网状结构的凝胶。这个网络就像一个个筛孔。

琼脂糖浓度对迁移率和分辨率的具体影响：

a. 对迁移率（Mobility）的影响

对于同一大小的DNA片段，琼脂糖浓度越高，其受到的阻力越大，迁移速度越慢。反之，浓度越低，迁移越快。

因此，在不同浓度的凝胶上，同一个DNA片段的迁移位置是不同的，不能直接比较。

b. 对分辨率（Resolution）的影响

分辨率是指将大小相近的DNA片段分离开的能力。这是琼脂糖浓度最重要的影响。

• 低浓度凝胶（如0.5%-0.8%）：

筛孔大，允许大片段DNA（>10 kb）有效分离。小片段DNA跑得飞快，但彼此之间难以分开，会挤在一起形成模糊的一条带。

优点：适合分离大片段DNA。

缺点：凝胶非常脆弱柔软，容易破损。

• 中等浓度凝胶（如0.8%-2.0%）：

这是最常用的范围，提供了一个良好的平衡，能有效分离0.5 kb - 10 kb范围内的DNA片段，足以满足大多数常规实验（如质粒、PCR产物、酶切产物的鉴定）。

1%与1.7%琼脂糖凝胶外观对比

1%与1.7%琼脂糖凝胶分辨率对比

M1: 100bp Ladder; M2: DS2000; M3: DS5000; M4: 1kb Ladder

 

• 高浓度凝胶（如2%-3%）：

筛孔小，能很好地分离小片段DNA（<1 kb），甚至能分辨出几十个碱基对的差异。大片段DNA则几乎无法移动，停留在加样孔附近。

优点：对小片段DNA分辨率极高。

缺点：凝胶脆性大，易碎。

👉 浓度错误直接导致分辨率下降，大片段跑不动，小片段跑成一团。

 

🚩 常见误区二：电压越高越好

琼脂糖凝胶电泳里电压是个很关键的因素，直接影响到DNA/RNA 迁移速度、条带清晰度和分离效果。

1. 电压与迁移速度

• 高电压 → 分子迁移更快：电场力更强，带负电的核酸分子快速向正极移动。

• 低电压 → 迁移较慢：分离过程更温和，条带移动较慢。

2. 电压与分辨率

• 低电压（常用 4–6 V/cm）：迁移慢，但小片段与大片段的分离效果更好，分辨率高，适合区分相邻大小的条带。

• 高电压（>10 V/cm）：条带跑得快，但容易拉宽、拖尾，分辨率下降。

4V/cm、7V/cm、9V/cm电压分辨率对比

M1: 100bp Ladder; M2: DS2000

3. 电压与热效应

• 高电压 → 产生焦耳热：缓冲液升温，凝胶变软甚至熔化，导致条带弯曲（smiling bands，笑脸效应）。

• 散热不足：DNA 迁移速率不均匀，上下条带弯曲，DNA降解，影响结果准确性。

• 解决办法：降低电压，或者在低温条件下电泳（冰盒、电泳槽加冰袋）。

9V/cm电压下不同电泳时间对比

M3: DS5000; M4: 1kb Ladder

4. 实验常用电压范围

• 常规琼脂糖凝胶（0.7–2%）：4–10 V/cm（电压与电泳槽两电极间距离有关）。

• 小片段 DNA 分离（几十到几百 bp）：可稍高电压（8–10 V/cm）。

• 大片段 DNA（>10 kb）：应低电压（3–5 V/cm），防止扩散和分辨率丢失。

电压越高，电泳越快，但分辨率和凝胶完整性可能受影响；低电压迁移慢，却能获得更清晰、更可靠的分离效果。

👉 推荐 5–10 V/cm，电极间距 20 cm 时，电压保持在 100–200 V 之间。

🚩 常见误区三：只靠上样染料定位

上样缓冲液是DNA电泳中不可或缺的组成部分，它通常含有两种主要成分：

1. 惰性染料（如溴酚蓝、二甲苯青）：用于实时监控电泳进程。
2. 增稠剂（如甘油、蔗糖、Ficoll）：增加样品密度，确保样品沉入加样孔底部。

染料在电泳中起到了“视觉参考线”或“前锋”的作用，其定位功能主要体现在：

1. 指示电泳进程，统一上样基准。
2. 预估DNA片段的迁移位置：
   • 不同的染料在不同浓度的琼脂糖凝胶中，其迁移行为与特定大小的DNA片段相似。因此，它们可以用来粗略估计未知DNA条带的大小。
   • 溴酚蓝（Blue：在0.8%-1.0%的琼脂糖凝胶中，其迁移速度大约与300-500 bp的DNA片段相当。
   • 二甲苯青（Blue：在0.8%-1.0%的琼脂糖凝胶中，其迁移速度大约与4000-5000 bp的DNA片段相当。
   • 例如： 如果你看到溴酚蓝条带快跑出凝胶了，你就知道所有小于500 bp的DNA片段可能已经接近凝胶底部，即将跑出。

👉 不能凭染料位置判断片段大小，这也是为什么 DNA Marker 在电泳中不可或缺。

🚩 常见误区四：Marker 随便用

在分子生物学实验中，DNA Marker常被简单视为泳道中的“对照”或“标尺”，但它的作用远不止于此。Marker的选择直接决定了实验数据的可解释性、准确性和美观度，是实验设计中最容易被忽视却至关重要的一环。一个不合适的Marker可能导致整个实验结果失去价值。

低质量或不匹配Marker带来的三大问题：

1. 片段分布稀疏：导致大小判断“失准”
   • 问题： 当Marker的条带间隔过大，或恰好在你目标片段的关键区域缺少条带时，你无法进行精确的插值估算。例如，如果你的PCR产物在750 bp左右，而Marker仅在500 bp和1000 bp有条带，你只能模糊地估计产物大小在“500到1000 bp之间”，无法得出准确结论。
   • 后果： 实验数据的精确度大打折扣，无法满足克隆鉴定、酶切验证等对大小要求严格的实验需求。
2. 条带模糊拖尾：影响结果呈现与可信度
   • 问题： 由于保存不当、反复冻融或生产工艺问题，Marker条带可能出现扩散、模糊或强度不均（有的亮有的暗）。这不仅影响观察，更严重影响成像质量。
   • 后果： 在论文、报告或展示中，模糊的Marker会让整个实验结果显得不专业、不可靠，降低数据的可信度。审稿人或同行可能会因此质疑你的实验严谨性。
3. 缺少关键指示条带：降低实验效率
   • 问题： 许多高效能的Marker会在500 bp、1000 bp、1500 bp和2000 bp等关键位置设置特别亮、特别粗的“指示条带”或“参考条带”。
   • 后果： 缺少这些指示条带，你在快速浏览凝胶时就无法瞬间定位。你需要花费额外的时间去数条带、比对大小，大大降低了实验分析的效率。尤其在处理多个样品时，这种效率损失尤为明显。

如何选择一个“合理”的Marker？

一个优秀的Marker不应只是DNA片段的简单集合，而应是一个精心设计的测量工具。以下是选择标准：

👉 1. 覆盖合适的片段范围
这是最基本的要求。选择的Marker其条带范围必须将你的目标DNA片段“包围”在中间，而不是落在两端。例如：

• 常规PCR产物鉴定（100 bp - 2 kb）： 选择范围覆盖100 bp至2000 bp的Ladder，如著名的100 bp Plus Ladder或1 kb Plus Ladder。
• 大片段酶切或基因组DNA分析（>5 kb）： 应选择λ DNA HindIII digest等大片段Marker。
• 小片段 miRNA/siRNA 分析（<100 bp）： 需要专门的低分子量Marker。

👉 2. 条带清晰、浓度均一

• 清晰锐利： 每条带都应边界清晰，无拖尾或扩散现象，这表明生产工艺好且保存得当。
• 亮度均一： 理想状态下，所有条带应具有相近的亮度（即DNA含量一致），这确保了不同大小的条带都能被清晰成像，不会出现小条带看不见、大条带又过曝的情况。

👉 3. 含有突出的指示条带，便于快速定位

• 这是区分“优秀”Marker和“普通”Marker的关键。许多高端Marker会特意将500 bp和1000 bp（有时还包括1500 bp和2000 bp）的条带做得更浓、更亮。
• 好处： 在紫外灯下，你的眼睛能立刻抓住这几个“地标”，瞬间建立起凝胶的空间距离与分子大小的对应关系，无需仔细数格子，极大提升了判读效率。

🚩 常见误区五：忽略缓冲液与染料差异

在琼脂糖凝胶电泳中，新手往往将全部注意力集中在琼脂糖浓度和电压设置上，而忽略了两个同样至关重要的因素：电泳缓冲体系和核酸染料。它们并非“通用”的试剂，其选择直接影响DNA的迁移率、条带分辨率和实验安全性，错误的选择会悄然破坏你的实验结果。

一、电泳缓冲液：不仅仅是导电的溶液

最常用的缓冲液是TAE和TBE，它们化学成分不同，决定了其特性和适用场景截然不同。

👉 如何选择？

• 首选TAE的情况： 进行大片段DNA分离（如基因组DNA酶切）、DNA胶回收（兼容性更好）或需要快速电泳时。
• 首选TBE的情况： 进行小片段DNA分离（如PCR产物、SSR分析）、高分辨率电泳（如区分相差几十bp的条带）或需要长时间电泳时。

⚠️ 重要提示：绝对不可将TAE和TBE缓冲液或其浓缩母液混用！ 这会导致pH和离子强度异常，产生不可预测的迁移结果。

二、核酸染料：安全与效能的权衡

染料的选择关乎实验结果的清晰度和操作者的生命安全。

👉 如何选择？

• 追求成本与灵敏度： 可能仍在用EB染料，但必须配备严格的防护和废物处理流程。

• 追求安全与便捷（现代实验室首选）：AIE-Gelgreen或GelRed是更安全的选择，尤其适合教学实验室或没有专门EB处理设施的实验室。它们通常与蓝光成像系统配套，能最大程度减少对DNA的损伤（UV会使DNA产生嘧啶二聚体，影响下游实验）。
• 注意： 如果实验下游需要进行胶回收克隆，建议选择对酶活影响更小的染料。

总结与实验设计指南

忽略缓冲液和染料的选择，就像用错误的尺子和昏暗的灯光去测量一个精细的零件。

👉 在设计实验时，请遵循这个流程进行选择：

• 看片段大小：
  • 大片段(>5 kb) → 优先选TAE缓冲液。
  • 小片段(<1 kb) → 优先选TBE缓冲液，以获得更高分辨率。
• 看实验目的：
  • 常规鉴定 → 可选择性价比高的方案（如DSView染料、EB染料）。
  • 胶回收 → 优先选TAE + 对酶活无抑制的染料（如AIE-Gelgreen）。
  • 发表级高清图片 → 优先选高分辨率缓冲液(TBE) + 高灵敏度/低背景的染料（如AIE-Gelgreen）。

AIE-Gelgreen核酸凝胶染料

• 看安全性与成本：
  • 安全绝对优先 → 毫不犹豫地选择AIE-Gelgreen等安全染料和蓝光成像系统，即使成本稍高。
  • 权衡迁移准确性 → 如果担心某些染料影响迁移，可在Marker和样品中使用完全相同的上样缓冲液和染料负载，以消除误差。

因此，将缓冲液和染料视为与凝胶浓度、电压同等重要的核心实验参数，根据你的具体需求进行理性选择，是获得可靠、美观、安全实验结果的必备步骤。

 

✅ 小结

DNA 电泳看似“基础”，却暗藏不少原理性细节。掌握浓度、电压、缓冲液、Marker 与染料的选择规律，才能保证结果：

• 条带清晰

• 分辨率高

• 实验可重复、可展示

 

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