PCR（聚合酶链式反应）几乎是分子实验室里最常见的技术之一。但有时候，做着做着，条带就是不上镜：要么无条带，要么全是拖尾，要么阴性对照还神奇地亮了……🤯
别急！今天我们就来盘点 PCR失败的5个常见原因，并提供实用的解决办法，帮你少踩坑。
1️⃣ 模板DNA质量或浓度不合适
🔍 表现：无条带、条带过弱或拖尾。
📌 原因：DNA降解、杂质残留，或者浓度过低/过高。
✅ 解决办法：
- 保证DNA纯度（A260/A280 = 1.8–2.0）；
- 稀释过浓模板；
- 植物/土壤等样本建议用高纯度提取试剂盒。
2️⃣ 引物设计或浓度有问题
🔍 表现：非特异性条带、引物二聚体。
📌 原因：引物设计不合理，浓度过高/过低。
✅ 解决办法：
-
长度18–25 bp，GC含量40–60%；
-
避免3’端互补；
-
终浓度一般0.1–0.5 μM，必要时做梯度PCR优化。
3️⃣ PCR体系或酶活性问题
🔍 表现：完全无扩增或扩增效率低。
📌 原因：Taq酶失活、Mg²⁺浓度不合适、dNTP降解。
✅ 解决办法：
-
分装保存酶，避免反复冻融；
-
优化Mg²⁺浓度（1.5–2.5 mM）；
-
用新鲜dNTP；
-
推荐选择性能优异的PCR预混液 👉 预混液中已优化了缓冲体系和酶活性，能显著提升扩增成功率，减少反复调试的时间，非常适合常规科研实验。
4️⃣ 实验操作污染
🔍 表现：阴性对照也出现条带。
📌 原因：PCR产物残留、移液枪污染、空气中DNA污染。
✅ 解决办法：
-
严格分区操作（提取区/体系配置区/产物分析区分开）；
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用带滤芯的枪头；
-
定期清洁实验台，使用核酸去除剂。
5️⃣ 循环条件设置不当
🔍 表现：条带模糊、非特异性扩增或无结果。
📌 原因：退火温度过低/过高、延伸时间不足、循环数过多。
✅ 解决办法：
-
根据引物Tm值设置退火温度；
-
延伸时间约 1 kb/min；
-
循环数控制在30–35次。
🧪 总结
PCR失败并不可怕，常见问题主要集中在 模板、引物、体系、操作和循环条件 这五个方面。逐一排查，总能找到原因。
而对于高校实验室或科研人员来说，选择一款高性能PCR预混液，往往能让PCR事半功倍，节省大量试错时间。
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